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検査の樹―復習から明日の芽を

7. 血栓症におけるPT-INRの意義と検査上の課題

1:血栓症について

今回は、凝固系検査の中のPT-INR(International Normalized Ratio:国際標準比または国際標準化比)に限定して、本検査の意義と測定値の施設間格差の収束を図るための要点を理解し復習していただくために、血栓症関連分子の作用と検査上の基礎的関連因子を整理しながら展開する。なお、本稿では、理論だけでなく検査の実際についても加味するため菊池匡芳氏(A&T)にご協力いただいた。

血栓症は、脳梗塞、心筋梗塞、肺塞栓などに代表される凝固関連性疾患で、厚生労働省平成18年の死因別死亡数の割合によると、悪性新生物(30.4%)、心疾患(15.9%)、脳血管疾患(11.8%)と悪性新生物に次いで全体のほぼ3割近くを占める患者の生命を奪いかねない恐ろしい病気である。血栓症は、厄介なことに、大半は直前まで無症状なヒトが突然に発症することが多い。さらに、多くの患者において 発症後は、生命の危機を取り留めても不可逆的な機能障害が残る、繰り返す再発によって機能障害が悪化するなど、一瞬にして患者の生活状態を激変させる疾患である。

ヒトは、多くの関連因子が緻密に統括された凝固機構を有し、多量の止血因子を保持するなど、出血に対する防御機構は万全に近いが、その反面血栓症に対しては極めて弱い一面がある。体内では、血管を反応の場として、血小板と凝固因子が共役して止血作用を発揮し、これと同じ血小板と凝固因子が共役して血栓症を発症させるという不可解な現象が生じている。

血栓症は、血流が速い部位での動脈血栓症(脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈血栓症)と血流の遅い部位での静脈血栓症(深部静脈血栓症、肺塞栓)とに分類される。動脈血栓症の血栓は血小板含有量が多い白色血栓を形成することが多く、治療は主に抗血小板療法が用いられている。静脈血栓症での血栓は凝固因子の関与が大きく、フィブリンと赤血球含有量の高い赤色血栓を形成するため、治療には抗凝固療法が用いられる。このような抗血栓療法に用いられる代表的な薬剤として、抗血小板療法ではアスピリンなど、抗凝固療法ではワルファリンなど、線溶療法ではウロキナーゼなどが使用されている。

2:抗凝固剤ワルファリンの作用と留意点

この中で今回のテーマと関連性を持つ抗凝固剤ワルファリン(ワーファリン *商品名→ビタミンKと類似構造)は、肝臓でビタミンK依存性カルボキシラーゼが凝固因子タンパク質のII、VII、IX、X のグルタミン酸をγ‐カルボキシル化し、凝固能を有したタンパク質への変換をビタミンKと拮抗的に抑える薬剤である(γ‐カルボキシル化されなかった凝固因子タンパク質はCa2+が結合できないため凝固活性を持たない。このタンパク質はPIVKA:protein induced by vitamin K absence or antagonistsと呼ばれている。例えばPIVKA II など)。

ワルファリンは、凝固因子タンパク質の生合成を阻害し、抗凝血作用、血栓形成の予防作用を有する経口薬剤で、心臓弁膜症における人工弁術後や心房細動が原因と予測される脳梗塞予防などに用いる。投与量が多過ぎると出血傾向に、少な過ぎると血栓症の危険性が高くなる。そのため、血栓症予防を目的とした投薬量の設定は重要で、薬効評価に用いられる検査値には高度な正確性が求められる。

また、本剤の代謝酵素のCYP2C9という肝代謝酵素の遺伝子多型が人種間差(モンゴロイド、コーカシアン、アフリカン)として明らかとなり、SNP(一塩基多型:Single Nucleotide Polymorphism)を配慮した投与量調節も論議されている。また、本剤は多くの併用薬剤により作用抑制や作用増強を受けるため、服用に際しては注意が必要である。さらに、ビタミンKを多く含む納豆(納豆はビタミンK合成能力の強いBacillus subtilisを含む)やクロレラなどの食品の影響も受けやすく、投与量の設定はさらに困難となっている。

3:ワルファリン服用中の薬効評価としてのPT-INR

ワルファリン服用中の薬効評価として、臨床検査のPT-INRが用いられている。PT-INRは、PT(プロトロンビン時間)測定値を国際間や施設間格差のない正確な絶対的数値を臨床サイドに提供する目的で設定されたものである。 本剤投与の対象となる患者では、通常PT-INRを1.6~3.0に調整していくが、日本人(モンゴロイド)では、当然目標とするINRは疾患や患者によって異なり、高度な抗凝固効果を目指す場合はINR2.0~3.0で、これは常に確実に2.0を超えるという意味である。また、軽度の抗凝固効果を目指す場合はINR1.6~2.4とし、基本的には2.0を超えるように投与調整される。実際、心房細動による服用例では、INR2.0未満になると血栓症発症の危険性が高まるとの報告がある。

PTは、クエン酸加静脈血漿にカルシウムと組織トロンボプラスチンを加え、フィブリンが析出するまでの時間を測定する凝固反応の外因系と共通系の凝固異常を調べる検査である。このPT検査の結果報告には、凝固時間、PT比(プロトロンビン比)、PT活性%、PT-INRなどいくつかの表現法があるが、今回はPT-INRに限定して進めたいと思う。

PT-INRは、以下の式で導く、患者プロトロンビン時間を正常プロトロンビン時間で割りつけたもの(PT比)を、ISI(国際感度指数:International Sensitivity Index)で累乗したものである。WHOが認定した標準トロンボプラスチン(いわゆるPT国際標準試薬)は、グローバルな共同研究結果に基づいて、用手法(WHO tilt-tube method)で測定した場合のISIが値付けられている。任意のPT測定システム(PT測定装置-PT測定試薬の組み合わせ)でのISIは、そのISIに整合性があるように値付けられている。この意味から、ISIはPT測定システム間、施設間の差異をなくす係数といって良い。

INR = (PTtest/PTnormal)ISI

ISIは、上記の通り、単に感度を合わせるための係数という意味しかないが、一般的に0.9~1.7の範囲が良いとされ、1.0に近いものが望ましいとされている。これは、ISIが低いほど患者プロトロンビン時間と正常プロトロンビン時間との差が大きくなる、いわゆる正常と異常の分離度が良いという観点からの評価であろう。PT試薬メーカーがPT測定システム(PT測定装置-PT測定試薬の組み合わせ)ごとに値付けして表示しているが、値付け方法などに起因する疑問も捨てきれない一面がある。ISIは、PT測定試薬の添付文書に記載されている。

PT-INRは臨床検査の中で臨床化学の血清K値と同じように、測定値の誤りは患者の生命に直結しかねない臨床上重要な検査項目の一つである。K値の測定では標準品との対比によって絶対濃度を測定できるが、PTは複数因子が関与する凝固反応の生物活性を測定するため、真値を示す標準物質がない(PT国際標準試薬はあるが、PT-INRが値付けられた国際標準血漿はない)。 また、図1に示したように凝固反応にかかわるタンパク質の半減期は約3時間から約6日間と大きく異なり、分析結果と投薬の効果反映にtime lagを生じるため薬効評価には充分な配慮が必要となる。

凝固因子の半減期、分子量、血漿中濃度

図1 凝固因子の半減期、分子量、血漿中濃度

また、試験管内反応と比べ生体内反応はさらに複雑巧妙な機構が働いている。通常のタンパク質は、必要時にDNA→転写→翻訳→修飾の過程を経て生成され、作用部位に移動して活性発現する手順をとるが、出血に対応する凝固系タンパク質は、補体系酵素の一部や消化酵素、アポトーシス酵素などと同じく急な反応に素早く対応できるように前駆体酵素として作り置きされ、必要時までは活性発現しないような機構が施されている。また、この前駆体酵素群はカスケード反応により連続的に順次活性化され、いくつかのポイントで複合体を形成し、これにより止血活性は大きく増強されていく。また、止血因子は図1に示したように体内に必要推測量の数倍から十倍量が準備されているなど、生体内反応は巧妙かつ的確な制御機構が作用している。

4:血液凝固反応-複合体形成による活性の増幅

前述のように血液凝固は、損傷が起きた場所を正確に特定し、必要な時だけ修復機能を作用させる。さもないと血管内腔に凝血塊ができて血管を塞ぎ、心筋梗塞や脳梗塞を引き起すことになる。このため、血管の周りにある細胞は、凝血塊作用のトリガーとなる組織因子(TF)を持っているが、血管の内側を覆う細胞は持っていない。

このような構造により、TFとの接触は、血管の損傷を意味すると同時に損傷部位の正確な特定がなされる。図2に示したように、生体内の凝固反応は複数の前駆酵素が順次活性化される単純な連鎖反応ではなく、TFの誘発により、これにVII因子が結合し、VII因子はXa、IXa、XIIa因子によってVIIaとなる。図3に分子構造模式図を示したように、実に正確かつ巧妙に接合したTF-VIIa複合体は、VIIa単独と比べ千倍近くペプチド水解活性が増強し、IX、X因子を活性化する。活性化されたIXa因子はVIIIa因子と複合体(テンナーゼ複合体)を形成し、X因子を活性化させXa因子となる。Xa因子はVaと複合体(プロトロンビナーゼ複合体)を形成し、プロトロンビン(II)を活性化しトロンビンを生成する。このように凝固反応は、酵素・補酵素・基質との3要素から構成された機能的な分子集団である。

この流れの中で、IXaやXaは単独よりも複合体を形成することにより反応速度は10万倍にも増幅して伝達され、止血反応を短時間で終結させる機構が働いている。分子集合したミセルの複合体形成には、陰性荷電リン脂質膜表面で進む特異性と特徴があり、リン脂質はCa2+を介してγ-カルボキシグルタミン酸(Gla)を有する凝固因子(VII、IX、X、II)が結合し、特定の細胞膜上に凝固因子が凝縮され効率的に反応が促進される。またこの時、TF、VIIIa、Va因子は補酵素タンパク質として、それぞれVIIa、IXa、Xa因子の膜上でのレセプター的役割を演じている。このように、in vivoにおいては、いくつかの複合体形成による活性の増幅機構が働いている。さらに、生体内での凝固反応にはアンチトロンビンIII、プロテインC、プロテインS、組織因子系制御などが複雑に作用制御しながら高度化した凝固制御機構が働いている。 このように、見事なまでに複雑かつ多様に制御された凝固機構の生物活性を測定する検査ゆえに、忠実かつ正確な活性値測定をするための創意と努力は不可避といえる。

血液凝固とビタミンK依存性凝固タンパク質

図2 血液凝固とビタミンK依存性凝固タンパク質

Tissue FactorとFactor Vll、calciumとの結合
Tissue Factor

Tissue FactorとFactor Vll、calciumとの結合
Tissue FactorとFactor VII、calciumとの結合

図3 組織因子の模式図

5:PT測定試薬-組織トロンボプラスチン

実際にPTを測定する際の試薬として加える組織トロンボプラスチンは、緻密に連結した分子複合体を形成する生物活性を測定するため、動物間での微妙な組成や構造上の差異が活性にも強く影響する。本来、ヒト由来のものが適切と思われるが、入手上の制約が伴うため動物由来品などに頼らざるを得ない。リコンビナント品は製品の安定性、量、動物入手などの対策にはなり得るが分子の高次構造や糖鎖付加、選択遺伝子や発現生物細胞などの課題を残している。現状ではこれらの課題を加味して製品を選択しなくてはならない。

現在は、ウサギ脳由来のトロンボプラスチンを主成分とするトロンボプラスチン・Cプラス、トロンボチェックPTプラス、ヒト胎盤由来のトロンボプラスチンを主成分とするトロンボレルSおよび、リコンビナントティッシュファクターを用いたデイドイノビンなどがある。近年の高度化した生物製剤の製造技術力をもってしてもロット間の活性の僅少化やリコンビナント製品の生産制御などにも限界があるため、完全なロット間差の完全な解消は困難であり、標準化品を設定し、対比分析による相対的係数補正や濃度調整などがどうしても必要である。

6:PT-INR高値域での測定法・施設間格差と収束への対策

PTの測定は秒で表示するよりもINRで表示することにより施設間格差は比較的小さくなったが、施設間で多様な測定試薬や分析機器が導入されているため、施設間格差は満足できるまでの収束には至っていない。特にPT-INRが高値の領域でその乖離は大きい。この原因としては、試薬トロンボプラスチンの由来動物種や組成、対照血漿に市販の管理血漿を用いたか、健常人のプール血漿を用いたかなどの相違点と、使用する分析機器や使用法などが多様なため、試薬メーカーが表示したISIが個々の施設値に対応できず、微妙に異なるケースが見られる。

PT-INRは前述のように、検体との正常対照試料との比をISIで累乗するため、ISIに誤差が生じた場合は薬効評価に必需な高値域ほど大きな乖離が見られ、治療に支障をきたす可能性がある。このため、測定試薬を変更する場合や試薬のロットが変わる場合は、事前に試薬に添付表示されているISIと自施設で求めたISIとを検証し、PT-INR表示試料やワルファリン投与患者血漿などを用いてPT-INR高値域での相関性を検証すべきである。PT測定試薬を変更する場合は、特に慎重を期すべきである。

PT-INRの施設間格差を収束するための検証法としては、

1)
Local SI方式:WHO標準試薬と対象試薬を用いて各施設の機器・試薬によりPTを測定し、回帰式から各施設での測定法を較正する補正SIを設定する
2)
Local ISI方式:WHO標準試薬と正常・患者血漿の代わりにINR表示血漿のPTを測定して得られた回帰式の傾きから補正SIを設定する
3)
Local calibration(L-C)方式:INR表示血漿のINRから各施設の機器・試薬で検量線を作成し、PTの実測値をプロットして検体のINRを直接求める

が提唱されている。

この中で比較的実施しやすい2)の方法を選択し、較正前後でのPT-INRの比較を表1に示した。このように、ISIの相違によるPT-INRの施設間乖離がISIを設定することにより施設間格差の収束が認められた。しかし、2)の方法を使用する場合でも、施設で使用しているPT測定システムが、PT-INR表示血漿の感受性と実検体の感受性とが一致するシステムであることをまず確認して行う必要がある。また、それ以上に問題なのは、ISIを用いてPT-INRを算出している施設数は、わが国では約10%しかないという現実である(平成20年度日本臨床衛生検査技師会調査より)。

表1
PT試薬での相関性(試薬添付のISIにてPT-INRを算出)

  測定装置α-試薬A 測定装置α-試薬B
測定装置α-試薬B γ=0.973
Y=0.73x+0.25
測定装置α-試薬C γ=0.972
Y=0.80x+0.14
γ=0.959
Y=1.04x-0.03

回帰式値の比較

A試薬:PT-INR 1.00 3.00 4.00
B試薬:PT-INR 0.98 2.44 3.17
C試薬:PT-INR 0.94 2.54 3.34

PT試薬での相関性(Local ISIにてPT-INRを算出)

  測定装置α-試薬A 測定装置α-試薬B
測定装置α-試薬B γ=0.977
Y=0.95x+0.11
測定装置α-試薬C γ=0.961
Y=0.93x+0.12
γ=0.960
Y=0.98x+0.03

回帰式値の比較

A試薬:PT-INR 1.00 3.00 4.00
B試薬:PT-INR 1.06 2.96 3.91
C試薬:PT-INR 1.05 2.91 3.84

グローバルな標準物質がないPT検査などの生物活性の測定法では、換算に用いる係数類の検証が不可避である。ましてや、国際的な人的交流が深まる今日において、国際的に共通している表記法の採用と正確な換算指標値を追求する検証は検査室が果たすべき義務であり、臨床検査の信頼を高める地道な技術研鑽といえる。

7:再検の意義とその認識

『再検しました。』語彙的には一見慎重な意を含む言葉であるが、内容的には非常にあいまいな危険を内包した言葉といえる。すなわち、発信者の認識と受信者の認識とにギャップがあった場合、お互いが描く内容には大きな歪が生じる。例えば、疑義あるデータが検出された場合、単に同じ検体を使って同じ測定機器で測定した結果、近似値が得られたとしても分析精度の高さを示すもので真値を追求するための再検ではない。しかし、報告時に冒頭の言葉を添えると主治医は真値追求の再検を終えた結果と信じる。

分析機器のトラブルが明白な場合は、まず同じ検体を用いた再検査を施行するが、これはテクニカル上の問題であり患者データの真値の検証という観点には寄与しないことである。測定系のトラブルが考え難い場合、あるいは疑義あるデータが出た場合(例えば、抗凝血薬療法を行っているのにPT-INRが正常値付近、あるいは正常値より若干低い値が報告されてきた場合や適正量のワルファリンを投与していると思われるのに高度異常のPT-INRが報告された場合など)は、まず採血担当者に直接、採血状況を問い合わせる。

採血時スムーズに血管に挿入できたか否か、凝固検査の採血は真空採血の場合は1本目ではなく2本目に行ったか(1本目は組織液の混入が多いといわれている。ただし、注射器で採血した場合は、1本目に入れて抗凝固剤と早く混合する)、採血量は適正であったか(抗凝固剤が液体のため規定量を採血する。特に異常値検体では正確な採血量は必須である)、採血後速やかに充分な混合を実施したかなどの基礎的なことを問い合わせる。

もし、懸念されることがあれば、患者に対する検査値の重要性を説明し、再度採血をお願いすべきである。場合によっては、ビタミンK依存性凝固因子(第II、第VII、および第X因子)血漿中濃度の検査オーダーを出し、報告されたPT-INRとそれらの血漿中凝固因子の濃度比率とに整合性があることを確認する必要があるかもしれない。このような習慣や考え方を持つことにより、採血担当者と検査施行者、お互いが検査の留意事項への認識が高まるものと思われる。

PT-INRは、生体の高度な凝結制御機構に守られていながらも、投薬により凝血傾向を示す患者を抗凝血へ導く薬効評価の指標値を求める検査である。したがって、測定値の誤差は被検者によっては生命を落とす可能性も否定できない。in vivoの現象を忠実に反映する測定系の確立を目指すのは当然であるが、現実的には困難である。したがって、現行法のin vitroでの測定系を用いて真値に近似させ、in vivoの現象に近い測定値の構築を図る努力を怠ってはならない。再度、このような理念の基に採血指導から検査値の報告活用を検証してみてはいかがだろうか。

参考文献・web site

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福武勝幸:凝固検査の標準化の現状:プロトロンビン時間(PT)、生物試料分析 Vol.32.No.5.457-364(2009)
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3)
小宮山豊:臨床検査室から臨床へ(データとともに情報を)、血栓止血誌 19(4),474-477(2008)
4)
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北島勲:5.凝固・線溶と臨床検査、血栓止血誌 19(4),462-466(2008)
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http://www.pdbj.org/mom/index.php?l=ja&p=075
9)
出血性・血栓性疾患
http://blogs.yahoo.co.jp/comoson2000/58799427.html
10)
止血機構
http://hobab.fc2web.com/sub2-siketsukikou.htm
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トロンボテスト
出典:フリー百科事典『ウィキペディア(Wikipedia)』
12)
ワルファリン
出典:フリー百科事典『ウィキペディア(Wikipedia)』
13)
プロトロンビン時間
出典:フリー百科事典『ウィキペディア(Wikipedia)』
14)
Tissue Factor
出典:フリー百科事典『ウィキペディア(Wikipedia)』

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